Tahap-Tahap Proses Kultur Jaringan Tanaman Terlengkap

Tahapan Kultur jaringan tanaman terdiri atas beberapa tahapan yang harus dilaksanakan secara urut. Tahapan kultur jaringan dimulai dari menumbuhkan sel, jaringan atau organ yang diambil dari tanaman sumbernya (donor plant) pada media artificial/buatan di bawah kondisi lingkungan yang terkendali.

Tahapan kultur jaringan di antaranya:

• Persiapan bahan tanaman, 
• sterilisasi
• Perlakuan kultur
• pertumbuhan kultur dan 
• aklimatisasi.

Berikut ini penjelasannya:

A. Persiapan bahan tanaman

Persiapan bahan tanaman merupakan tahap pra-kultur (juga disebut tahap 0). Bahan tanaman yang akan dijadikan eksplan kultur jaringan disebut tanaman donor. Persiapan awal yang dilakukan yaitu pemeliharaan yang tepat tanaman donor pada rumah kaca (Green house) dengan kondisi bebas dari hama dan penyakit serta minim debu. Pengkondisian tanaman donor pada rumah kaca dengan area ruangan tertutup dan bersih merupakan usaha untuk menyediakan tanaman donor yang berkualitas tinggi dan bebas penyakit.

Kultur Jaringan

Pada tahap persiapan ini, tanaman donor mulai memperoleh pra perlakuan sebelum tanaman tersebut dijadikan eksplan kultur jaringan. Pengendalian kontaminasi dapat dimulai dengan pra perlakuan tanaman donor. Pra perlakuan dapat berupa fungisida dan pestisida yang berfungsi untuk meminimalkan kontaminasi pada saat kultur in vitro. Hal ini meningkatkan tingkat pertumbuhan dan multiplikasi kultur in vitro. Tanaman donor yang sehat dan bebas penyakit dijadikan eksplan kultur jaringan.

Umur tanaman juga mempengaruhi dalam pertumbuhan tanaman. Tanaman atau eksplan yang digunakan untuk kultur jaringan sebaiknya berada pada umur rata-rata dimana tanaman tersebut tidak terlalu muda dan juga tidak terlalu tua. Hal ini disebabkan apabila tanaman berumur terlalu muda maka kemungkinan untuk tumbuh dan berkembang sangat sulit karena tanaman yang masih muda mengandung senyawa fenol yang sangat tinggi sehingga akan mengakibatkan browning dan pada akhirnya eksplan akan mati.

Sedangkan apabila tanaman yang akan digunakan untuk eksplan berumur tua akan sulit untuk tumbuh. Hal itu disebabkan karena tanaman berada pada masa matur/ pertumbuhan yang lanjut sehingga sifat totipotensi pada sel tersebut sangat sedikit sekali atau bahkan tidak ada. Contohnya pada tanaman tebu, eksplan yang digunakan sebaiknya berumur sekitar 4-5 bulan.

B. Sterilisasi

Sterilisasi merupakan usaha membersihkan dan membebaskan suatu benda dari mikroorganisme seperti protozoa, fungi, bakteri, dan virus. Perbanyakan tanaman secara in vitro bertujuan untuk memperoleh bahan tanaman steril yang akan digunakan untuk perbanyakan bibit. Oleh karena itu, diperlukan proses sterilisasi yang tepat untuk mematikan mikroorganisme yang terdapat pada eksplan sehingga tidak mengganggu pertumbuhan tanaman. Sterilisasi memiliki peranan penting dalam teknik kultur jaringan. sterilisasi dapat mencegah kontaminasi pada saat perlakuan kultur.

Sterilisasi peralatan Lab

Pada banyak literature tahap sterilisasi ini disebut juga tahap inisiasi. Tahap inisiasi pada dasrnya yaitu inokulasi eksplan pada media steril untuk memulai kultur secara aseptik. Inisiasi eksplan adalah langkah pertama dalam kultur jaringan secara in vitro. Eksplan yang baik adalah eksplan bersih dan sehat yang terbentuk dalam kondisi aseptik sehingga bias diperbanyak secara massal.

Oleh karena itu, inisiasi eksplan dalam kondisi aseptik harus dianggap sebagai langkah penting dalam kultur jaringan, banyak kasus eksplan gagal terbentuk dan tidak berkembang bukan karena kurangnya media yang sesuai tetapi karena kontaminasi. Eksplan yang dipindahkan ke lingkungan in vitro harus bebas dari kontaminan mikroba. Untuk mendapatkan kultur yang bersih dari kontaminasi, eksplan harus disterilisasi.

Sterilisasi merupakan upaya untuk menghilangkan kontaminan mikroorganisme yang menempel di permukaan eksplan. Sterilisasi yang dimaksud dalam kegiatan ini adalah bahwa semua alat, bahan, kondisi laboratorium, eksplan, tempat inisiasi dan pekerja harus dalam kondisi aseptis.

Sterilisasi alat dan media kultur jaringan dilakukan sebelum perlakuan kultur dimulai. Kegiatan sterilisasi meliputi sterilisasi ruangan, sterilisasi alat tanam, sterilisasi media tanam, dan sterilisasi eksplan.

1. Sterilisasi ruang

Ruangan penanaman kultur (transfer area) harus dalam kondisi steril. Baik alat dan media yang digunakan untuk perlakuan kultur harus dalam kondisi steril. Untuk itu semua alat dan bahan juga disterilisasi sebelum memasuki ruang penanaman. Ruang pembuatan media biasa dipisahkan antara ruang penimbangan dan ruang tempat penyimpanan bahan kimia.

Bahan kimia sebaiknya ditempatkan pada tempat yang kering, karena berguna untuk menghindari mencairnya beberapa bahan kimia yang bersifat higroskopis. Ada beberapa bahan kimia yang ditempatkan dalam alamari es seperti hormon tanaman. Selain itu terdapat pula ruang asam untuk bahan-bahan yang mudah menguap.

Ruangan penanaman kultur biasanya tidak terlalu besar agar proses sterilisasinya tidak lama dan mudah. Ruangan penanaman kultur diusahakan tidak lembab dan disertai AC serta lampu UV. Sterilisasi ruangan dilakukan dengan menyemprotkan formalin pada tembok ruangan

kemudian menyemprotkan alkohol 96%. Begitu pula lantai di pel dengan kain yang dibasahi dengan alkohol 96%. Lampu ultraviolet dinyalakan sebelum perlakuan kultur dan dimatikan saat masuk dalam ruang ini. lampu UV harus diwaspadai karena dapat mengubah DNA dengan pembentukan dimer antara dua basa tirnin pada satu rantai DNA. Penetrasi sinar UV utamanya pada bagian superfisial dari jaringan sehingga dapat melukai kulit dan retina mata. Sinar UV dapat menghasilkan ozon sehingga jarak waktu memasuki ruang kultur setelah lampu UV dimatikan yaitu harus menunggu 15-30 menit supaya ozon tidak terhirup.

2. Sterilisasi alat dan media kultur

Semua alat logam dan gelas dapat di sterilkan dalam autoclave pada temperatur 121°C dan tekanan 1 atm, selama 30 menit, sedangkan sterilisasi bahan atau media kultur selama 15 menit. Alat-alat seperti pinset dan scalpel selain disterilkan dengan autoclave dapat dilakukan dengan pembakaran di atas api Bunsen dalam Laminar air flow. Botol-botol yang akan disterilisasi sebelumnya ditutup dengan kertas, aluminium foil atau plastik dan diikat dengan karet. Aquadest disterilkan seperti Sterilisasi alat selama 30 menit. alat dan media disemprot terlebih dahulu menggunakan alcohol 70% sebelum dimasukkan ke Laminar air flow (LAP).

Laminar air flow (LAF) modern memiliki sistem tersendiri untuk Sterilisasi. Biasanya LAF dilengkapi dengan lampu UV. Lampu ini dinyalakan selama 1-2 jam sebelum digunakan untuk mematikan mikroorganisme penyebab kontaminasi. Setelah itu untuk meyakinkan tingkat sterilitasnya, LAF disemprot dengan spirtus atau alkohol 70%. Permukaan LAF sebelum mulai bekerja dibersihkan dengan tisu yang sudah dicelupkan alkohol 70%.

Sterilisasi media kultur jaringan dapat menggunakan autoclave. Namun pada beberapa kasus sterilisasi media pada autoclave mempunyai banyak kelemahan yaitu apabila suhu terlalu tinggi dapat terjadi perubahan pada tekstur media seperti terbentuknya caramel coklat yang sifatnya racun sehingga dapat membuat eksplan mati, perubahan senyawa seperti sukrosa yang akan terurai menjadi fruktosa dan glukosa.

Selain itu, pH media dapat mengalami perubahan pada saat proses sterilisasi berlangsung, terjadi pengendapan garam-garam dan depolimerisasi agar. Beberapa komponen media ada yang tidak stabil kalau terkena panas yang tinggi, misalnya Gas, Ca-panthothenate dan Tiamin-HCI harus disterilisasi dengan ultra filtrasi (Millipore filter) pada suhu ruangan (25°C).

Sistem sterilisasi menggunakan Millipore filter ini dilakukan didalami ruang steril (lat) ketika medium agar telah agak dingin tetapi belum memadat. Ada beberapa macam Millipore filter, yang terbuat dari polyethylene film sekali pakai terus dibuang (disposable), ada Millipore filter yang dilengkapi dengan holder, filter holder ini dapat disterilisasi dengan autoclave (autoclavable). Porositas dari filternya juga bermacam-macam, mulai dari 0,22-0,45 pm. Untuk larutan termolabil dalam jumlah sedikit (5-50 ml) dengan mudah dapat disterilisasi dengan Millipore filter yang dipasang pada ujung syrink (alat suntik). Dalam jumlah besar (50-5000 liter) sterilisasi dengan ultrafiltrasi ini harus dibantu dengan pompa vakum.

3. Sterilisasi Eksplan

Teknik sterilisasi eksplan tanaman berbeda tiap tanaman satu dengan yang lainnya. Sterilisasi eksplan tergantung pada jenis tanamannya, bagian tanaman yang digunakan, morfologi permukaannya, umur tanamannya, kondisi tanaman (sakit atau sehat pada saat pengambilan), musim saat pengambilan, dan lingkungan tumbuh eksplan. Kultur jaringan dapat berupa organ, jaringan, maupun sel. Eksplan yang berasal dari organ lebih mudah dikulturkan, seperti : Akar, daun, batang.

eksplan tanaman dari lapangan banyak mengandung debu, kotoran-kotoran dan berbagai kontaminan lainnya seperti cendawan bakteri dan spora. Apabila kontaminan tidak terlebih dahulu dihilangkan maka di dalam media yang banyak

mengandung nutrisi dapat ditumbuhi bakteri maupun cendawan. Dalam beberapa hari saja eksplan yang telah ditanam akan tertutupi oleh kontaminan tersebut, sehingga eksplan akan mati.

Sebelum sterilisasi dilakukan, eksplan dicuci menggunakan sabun/detergent dan dibiarkan beberapa saat pada air yang mengalir selama 15-30 menit. Bahan yang sudah bersih dikecilkan ukurannya kemudian dibawa kedalaman ruang penanaman eksplan untuk disterilisasi lebih lanjut. Sterilisasi eksplan sangat beragam tergantung jenis eksplan. Sterilizer dapat berupa perendaman di dalam larutan sodium hypochlorite kemudian dicuci dengan air steril dilanjutkan dengan perendaman di dalam larutan sublimate dan pembilasan dengan air steril.

Untuk eksplan yang berdaging (umbi kentang, wortel), eksplan yang tertutup sarung daun (pucuk tebu), dan biji muda yang masih terdapat di dalam buah (anggrek) dapat disterilisasi dengan merendam di dalam alkohol beberapa saat, kemudian dilewatkan diatas nyala api dan dibiarkan sampai nyala api padam, cukup efektif untuk membawa kultur bebas dari kontaminasi.

C.  Penanaman Eksplan

Pada teknik kultur jaringan biasanya memanfaatkan perbanyakan tumbuhan secara vegetatif. Teknik kultur jaringan suatu sel atau sering disebut eksplan secara in vitro diletakkan dan dipelihara dalam medium cair atau padat yang cocok dan tentunya harus dalam keadaan bersih atau steril, dengan cara demikian sebagian sel pada permukaan irisan tersebut akan mengalami proliferasi dan membentuk kalus. Apabila kalus sudah terbentuk maka dipindahkan ke dalam medium diferensiasi yang sesuai, maka akan terbentuk tanaman kecil yang lengkap dan disebut planlet.

Tahapan penanaman eksplan yaitu Eksplan yang telah disterilisasi kemudian ditanam pada media yang telah dipersiapkan. Media yang sesuai merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi kecepatan pertumbuhan pada tahap selanjutnya.

Tahap penanaman eksplan

Jika penanaman telah selesai, botol-botol berisi eksplan dapat disimpan di dalam ruangan pertumbuhan atau di sebut juga growing area dengan suhu, kelembaban dan cahaya dapat dikontrol sesuai dengan kebutuhan pertumbuhan eksplan. Dalam ruangan tersebut, Tingkat sterilitas tetap dijaga dan dikontrol untuk mencegah terjadinya kontaminasi.

Penyimpanan Hasil Kultur

Sterilisasi harus di tingkatkan secara terus menerus karena Semakin rendahnya tingkat sterilisasi maka tingkat kontaminasi  pada eksplan juga akan semakin tinggi. Kontaminasi biasanya berupa jamur maupun bakteri. Selain itu terdapat pula browning. Browning ini ditandai dengan perubahan warna pada eksplan. lndikasi pertama yaitu timbulnya warna kuning pada eksplan. kemudian coklat dan selanjutnya menghitam. Pada awal pertumbuhan eksplan biasanya diawali terbentuknya kalus kompak pada bagian dasar eksplan.

Diperlukan beberapa pekan/minggu untuk melihat perubahan dan perkembangan eksplan sebelum dapat dilaksanakannya tahap selanjutnya.

D. Multiplikasi

Tahap multiplikasi bertujuan untuk memperbanyak dan memelihara eksplan dalam keadaan tertentu sehingga sewaktu-waktu bisa dilanjutkan untuk tahap berikutnya. 

Pada minggu pertama pertumbuhan biasanya eksplan membentuk akar kemudian membentuk tunas. Kemudian tunas tersebut selanjutnya akan dipisahkan untuk mendapatkan tanaman baru lagi. Multiplikasi tunas dapat dilakukan dengan memisahkan ujung tunas yang sudah ada yang telah menghasilkan buku baru atau ruas.

Tahap multiplikasi atau yang disebut juga fase perbanyakan dimana eksplan dikultur pada media yang tepat untuk perbanyakan tunas tanpa kehilangan stabilitas genetik. Hasil dari perbanyakan tanaman ini dapat digunakan lebih lanjut untuk perbanyakan dengan kultur berulang yang disebut subkultur ke media yang berbeda untuk pemanjangan. 

Pemanjangan Tunas dan Pengakaran

planlet yang telah ditanam dalam media kultur mengalami pertumbuhan hingga muncul tunas dan akar. Pemanjangan tunas dan pengakaran secara mikro dilakukan dalam media kultur dengan komposisi unsur hara mineral dan sukrosa yang lebih rendah dan konsentrasi agar lebih tinggi. Selain itu, dilakukan induksi tunas dan akar dengan menggunakan zat pengatur tumbuh. 

Penggunaan zat pengatur tumbuh dalam tahap ini bertujuan untuk membentuk organ yang siap aklimatisasi yaitu dimana Tunas dan akar dipersiapkan agar dapat bertahan hidup sampai saat dipindahkan dari lingkungan in vitro ke lingkungan luar. 

Sub kultur planlet ke media yang mengandung zat pengatur tumbuh untuk mendapatkan nutrisi yang dapat memicu tunas dan akar. Media sebagai pemanjangan tunas mengandung sitokinin yang sangat rendah atau tanpa mengandung sitokinin. Tunas tersebut dapat dipindahkan secara individu atau berkelompok. Jika pemanjangan tunas di lakukan secara berkelompok lebih ekonomis bila dilakukan secara individu. 

Setelah tumbuh cukup panjang, tunas tersebut dapat diakarkan. Pemanjangan dan pengakarannya tunas bisa dilakukan langsung sekaligus atau secara bertahap, misalnya setelah dipanjangkan baru diakarkan. Pengakaran tunas in vitro bisa dilakukan dengan pemindahan tunas ke media pengakaran yang memerlukan auksin seperti IBA atau NAA. Keberhasilan tahap ini tergantung pada tingginya mutu tunas yang dihasilkan pada tahap sebelumnya. 

E. Aklimatisasi Tanaman Kultur

Aklimatisasi adalah proses adaptasi tanaman hasil kultur jaringan terhadap lingkungan sekitar. Tahap ini merupakan peralihan dari keadaan yang selama ini terkontrol dengan baik secara in vitro, menuju kondisi lingkungan (suhu, iklim dan temperatur yang berubah ubah). Aklimatisasi disebut juga sebagai tahapan penyesuaian diri, sebelum pada akhirnya tanaman mampu hidup di lapangan. Tahapan ini merupakan tahap penting dan kritis setelah teknik kultur jaringan secara in vitro dilakukan. Apabila proses aklimatisasi tidak dilakukan dengan benar maka tanaman yang dihasilkan dari teknik kultur jaringan tersebut akan mati. 

Teknik Aklimatisasi terdiri atas pemindahan planlet dari botol kultur ke lapangan. Aklimatisasi meliputi pengkondisian plantlet atau tunas mikro di lingkungan baru yang septik diluar botol pada media tanah sehingga plantlet dapat bertahan dan terus tumbuh menjadi bibit yang siap ditanam di lapang. Plantlet dipindahkan ke lingkungan di luar botol seperti rumah kaca, rumah plastik, atau screenhouse (rumah kaca/ plastik untuk melindungi hama) sebelum dipindahkan di lapang. Biasanya planlet terlebih dahulu di tanam di dalam polybag agar planlet beradaptasi dengan lingkungan baru. Tahap aklimatisasi adalah periode penting dalam menentukan keberhasilan kultur jaringan agar beradaptasi pada lingkungan baru. 

Ciri-ciri planlet yang siap aklimatisasi yaitu 

• Planlet sehat dengan daun yang hijau serta perakaran yang kuat.
• Memiliki pertumbuhan yang seragam baik jumlah daun yang tampak sama dan tingginya 
• Media kultur dipenuhi dengan akar yang padat. 

Tanaman siap aklimatisasi

Berikut beberapa hal yang wajib diperhatikan pada saat proses aklimatisasi: 

1. Media tanam 

Media yang digunakan pada tahap aklimatisasi disesuaikan dengan jenis tanaman dan harus selalu lembab. Keadaan lingkungan yang lembab berfungsi untuk memenuhi kebutuhan air. Untuk menjaga kelembapan dilakukan penyiraman dua kali sehari. Selain itu Penyiraman berfungsi untuk melarutkan unsur hara yang dibutuhkan tanaman serta menjaga ketersediaan uap air. Proses penyiraman tidak boleh berlebihan karena tanaman dapat rusak/busuk serta terkena jamur ataupun bakteri. Penyiraman dilakukan dengan sprayer dengan teknik yang hati-hati agar media tidak terlalu basah ataupun tidak terlalu kering sesuai kebutuhan. 

Syarat media aklimatisasi utamanya: mempunyai kemampuan menahan air yang tinggi, memiliki aerasi untuk mempermudah pertumbuhan akar, bebas jamur dan tidak mudah menyatu. Beberapa media tanam untuk aklimatisasi yang telah banyak tersedia di toko pertanian diantara-Nya: moss, arang sekam, pakis, arang kayu dan tanah. 

2. Penggunaan Sungkup 

Tanaman harus di beri sungkup untuk melindungi tanaman sebelum benar-benar diletakkan pada lingkungan selama beberapa hari. Setelah itu pembukaan sungkup dilakukan secara bertahap agar tanaman tidak mengalami strees perlakuan karena perubahan kondisi kelembapan lingkungan. 

3. Naungan 

Naungan pada tanaman diberikan selama 5-7 hari. Intensitas cahaya yang digunakan yaitu sekitar 40-50 % agar tanaman dapat beradaptasi pada lingkungan diluar laboratorium yang biasanya memakai lampu TL untuk pencahayaan. Setelah 7 hari tanaman dapat diberi cahaya dengan intensitas yang lebih tinggi secara bertahap sampai tanaman benar-benar mampu beradaptasi dilingkungan luar. 

4. Pemupukan 

Pupuk digunakan untuk memenuhi nutrisi tanaman sehingga meningkatkan pertumbuhan tanaman. Pemupukan dilakukan setelah satu minggu penanaman planlet ke lingkungan. Pemupukan dilakukan dua minggu setelah aklimatisasi dengan komposisi pupuk majemuk yang mengandung N tinggi dengan dosis 1 gram per liter. 

Pemupukan dilakukan dua kali seminggu secara teratur. Pencegahan terhadap penyakit perlu dilakukan dengan cara menyemprotkan insektisida dan fungisida dua minggu sekali secara teratur. Jenis pupuk yang digunakan biasanya pupuk untuk pertumbuhan organ tanaman seperti Hyponex, Gandasil, atau Bayfolan. 

Aklimatisasi merupakan tahap yang penting dalam pembibitan lapang karena dapat berpengaruh pada persentase tanaman yang hidup. Dalam tahap ini planlet dikondisikan dengan perlakuan khusus agar dapat beradaptasi dengan lingkungan baru. Adapun tahap aklimatisasi diantara-Nya: 

1. Persiapan rumah kaca/ Green house Aklimatisasi tanaman hasil kultur jaringan dilakukan di dalam rumah kaca. Kondisi yang paling dibutuhkan pada saat melakukan aklimatisasi tergantung pada kualitas tanaman dan jenis tanaman. Rumah kaca dipersiapan sedemikian rupa dengan memperhatikan kelembapan, cahaya dan temperature.

   

   Aklimatisasi tanaman di rumah kaca

2. Persiapan planlet, Tahap awal dalam aklimatisasi yaitu memilih planlet yang baik. Pemilihan dilakukan melalui seleksi plantlet berdasarkan kondisi organ tanaman yang sehat. Hal ini dapat dilihat dari penampakan batang dan akar. Plantlet siap untuk diaklimatisasi ditandai dengan batang hijau tua dan telah mempunyai akar tunggang dan akar rambut. Planlet hasil seleksi dibawa ke rumah kaca kemudian dikeluarkan dari botol dengan menggunakan pinset secara hati-hati supaya akar tidak putus. Planlet dibersihkan dari media agar dengan cara dicuci pada air mengalir, selanjutnya direndam pada larutan fungisida dengan konsentrasi 1 gr/liter selama 2-3 menit. 
3. Pemilihan media tanam, Media yang digunakan untuk aklimatisasi disesuaikan dengan jenis yang akan ditanam. Media disterilisasi menggunakan autoklaf selama 30 menit kemudian didinginkan hingga siap untuk digunakan. Media direndam dengan pupuk menggunakan dosis tertentu sesuai dengan kebutuhan tanaman.
4. Penanaman Planlet, Planlet dikeluarkan dari botol kultur dengan menggunakan pinset. Teknik yang dilakukan untuk mempermudah pengambilan planlet dari botol yaitu memasukkan air steril pada botol sampai planlet terpisah dari media. Dengan kawat yang ditekuk ujungnya atau pinset yang berbentuk melengkung planlet dikeluarkan dengan perlahan kemudian dibersihkan pada air mengalir hingga bersih untuk menghilangkan sisa media. Sebelum planlet ditanam terlebih dahulu media tanam pada polybag kecil kemudian di letakkan pada traytray. Media tersebut sebelumnya disiram dengan air secukupnya, kemudian dibuat lubang tanam. Setelah media siap digunakan planlet ditanam dengan mengusahakan batang jangan sampai terendam media tanam. Pada saat penanaman dilakukan secara hati. hati karena planlet belum kuat, perakaran yang halus dan mudah patah. Penanaman sebaiknya dilakukan pada pagi hari dan di tempat yang terlindung dari sinar matahari. Secara teoritis di dalam botol kultur, planlet hidup berdesak-desakan satu dengan yang lain dan pada komuniti media tanam pun, kebiasaan seperti itu masih terus berlanjut. Sehingga tahap penanaman planlet ini diharapkan tanaman sudah dapat dilatih untuk mempertahankan hidupnya sendiri.
5. Pemeliharaan tanaman, Kegiatan pemeliharaan meliputi penyiraman, penggunaan sungkup dan pemupukan. Pemupukan dilakukan dua minggu sekali setelah aklimatisasi. kemudian Pembukaan dan pengguntingan sungkup dilakukan secara bertahap sedikit demi sedikit tiap minggu hingga keseluruhannya terbuka sehingga tanaman siap untuk dipindahkan ke lokasi baru. 

Daftar Pustaka

Anita sari, septrini dian (2018). Dasar teknik kultur jaringan tanaman. Yogyakarta. Deepublish.